十二、应用实例：
1.Analysis of Exenatide Variants艾塞那肽变体的分析(= Byetta®)
COLUMN:
PolySULFOETHYLA(3μm, 300Å two 100x4.6-mm columns in series)
2.Isolation of Glyco- & Phosphopeptides
via ERLIC*
通过ERLIC（静电斥力亲水色谱）分离糖质及磷酸肽
Example
1: ERLIC of HeLa Cell Lysate Tryptic Digest
HeLa细胞裂解液胰蛋白酶消解产物静电斥力亲水色谱分析（Hela细胞，有时音译为海乐细胞，亦称实验用增殖表皮癌细胞）
ERLIC是不需要梯度洗脱的梯度色谱！等度分离多肽，核苷酸与氨基酸！在ERLIC色谱柱上蛋白磷酸肽经过胰蛋白酶消化作用具有高分辨率的分离。用于完整的蛋白质分析的混合床离子交换柱。这是一种用于复杂提取物的蛋白组学分析的潜在的重要工具。在这种色谱柱上几乎所有的蛋白质都被保留。 1000 - Å孔径确保了即使是大的蛋白质也会有很好的尖峰。
A
100x4.6-mm column of PolyWAX LP® (5-μm, 300-Å) was used (item# 104WX0503). Over
3000
unique
tryptic phosphopeptides were identified. Solvents through Fraction 20 were
volatile.
对超过3000独特的胰蛋白酶磷酸化肽进行了鉴定。通过馏分20的溶剂是挥发性的。
Example 2: Isolation of tryptic phospho-and glycopeptides胰蛋白酶磷酸化和糖肽的分离
Column:
204WX0503 Flow rate: 1 ml/min. Detection: 214 nm
Gradient:
0-10’: 0%B; 10-35’: 0-30% B; 35-40’: 30-100%B; 40-50’: 100%B
MP
A: 10 mM Na-methylphosphonate, pH 2.0, with 70% ACN 钠 - 甲基膦酸二乙酯
MP
B: 200 mM TEA-phosphate, pH 2.0, with 25% ACN TEA-磷酸酯
(data courtesy
of S.K. Sze, Nanyang Technol. Univ.)
3. Mixed-Bed Ion-Exchange of Proteins 蛋白的混床离子交换
With complex protein
mixtures like lysates or serum, some protein will elute in the void volume from
any single ion-exchange column. With a mixed-bed column, though, almost all
proteins are retained, per the following example (a yeast lysate with a NaCl gradient
in MES buffer, pH 6):
与裂解物或血清这类的复杂蛋白质混合在一起，某些蛋白质可以从任何单离子交换柱的空体积洗脱。然而用混床柱，下面每个例子里几乎所有蛋白都被保留：
Serum Proteins on a Mixed-Bed Ion-Exchange
Column- gradient from 20-800 mM NH4OAc, pH 7 -混床离子交换柱上血红蛋白的分离
4.PolySULFOETHYL A™色谱柱的应用举例（单抗的强阳离子交换）
5.肽的阳离子交换
强阳离子交换材料(SCX)是专门为肽段的高效液相色谱(HPLC)而设计的。在pH值2.7-3.0的时候，多肽失去(-)离子而获得(+)离子，因此PolySULFOETHYL
A™是一种多用途的替代反相(RPC)的材料,多肽的分离是通过电荷而非极性。对比其他的基于磺丙基团的SCX材料, PolySULFOETHYL A™有显著的亲水性。将和肽的疏水相互作用降低到小,具有高复苏性以及更小的峰拖尾。生产力也很高,允许胰酶消化的弱碱性肽段有更好的保留和分离。离子交换的能力是类似的RPC柱容量的四倍。因而,离子交换应该是多步骤纯化的第一步。PolySULFOETHYL A™适用于:
混合肽段的多维高效液相色谱法,如胰酶消化的蛋白质组学分析(包括iTRAQ®和ICAT®*反应和产品)。
l 从天然产物分离的肽段。
l 质量控制和净化的合成肽。
l 选择性的分离胰酶消化的硫化物-肽、磷酸肽以及C端片段。
l 消化的肽段图谱(胰酶、V8、溴化氢等)
蛋白质也可以使用PolySULFOETHYL
A™柱；在PH3的情况下，保证能全部保留下来。比如通过亲水相互作用模式使用PolySULFOETHYL A™柱分离肺表面蛋白。
多肽分析的标准材质是300-Å,
3 -或5-µm两种可供选择。200-Å的材料大约有25%的更大容量，以及更加适用于磷酸肽的分离和iTRAQ®反应混合物肽段的分离。对于蛋白质,使用1000-Å的材料或者3-µm的1500-Å的材料。
值得一提的是PolyCAT™色谱柱
PolyCAT™色谱柱是血红蛋白分析的一个黄金标准，利用分子排阻方式分离像氨基酸一样的小分子
， PCR产物-高效液相色谱法能够替代凝胶 。
